Поширеність поліморфних алелей 2258G/A гена TLR2 та їх зв’язок з окремими імунологічними показниками серед хворих на алергічний риніт

Abstract

Актуальність. Сьогодні існує тенденція до зростання рівня поширеності алергічних захворювань в різних країнах світу, одним з найпоширеніших серед яких є алергічний риніт (АР). За сучасними уявленнями АР - мультифакторна патологія, що виникає в результаті взаємодії різних чинників довкілля і спадкової схильності. Кількість патологій з порушеннями в системі TLR росте. Для кращого вивчення і розуміння генетичної схильності до виникнення захворювання обґрунтованим є вивчення поширеності функціонального поліморфізму гена TLR 2 серед хворих АР. Метою дослідження стало вивчення поліморфізму 2258g/A гена TLR2 (rs5743708) серед хворих АР, аналіз імунологічних показників і клінічних проявів у хворих з поліморфними варіантами досліджуваних генів. У дослідженні проаналізовані клінічні прояви, стан клітинного і гуморального імунітету і поширеність поліморфних алелей 2258 G/A гена TLR2 серед хворих АР (n = 45) для вивчення механізмів патогенезу і розуміння генетичної схильності до виникнення цього захворювання. Обстежені 45 хворих АР віком від 19 до 65 років. Діагноз АР встановлювали на основі критеріїв діагностики ARIA (2008) по алгоритму діагностики, прийнятим в Україні і затвердженим МЗ України. Сенсибілізацію до алергенів діагностували на підставі комплексу алергологічних методів обстеження: збір алергологічного анамнезу, позитивних шкірних скарифікаційних тестів на алергени з використанням стандартних наборів (ТОВ "Імунолог", Вінниця, Україна). Виділення геномної ДНК здійснювали методом фенол-хлороформної екстракції. Визначення поліморфізму 2258 G/A гена TLR2 проведено методом полімеразної ланцюгової реакції. За стандартною методикою проведено визначення числа лейкоцитів в крові і підрахунок формених елементів крові в мазках. Фенотип лімфоцитів аналізували у венозній крові, використовуючи моноклональні антитіла до CD4, СD25 (виробництво "Сорбент", Росія) і внутрішньоклітинного білку Foxp3 ("Bioscience", США) методом проточної цитофлюориметрії за допомогою проточного цитофлюориметра EPIX LX - MCL (Beckman Coulter, США), використовуючи програму System II TM software. Рівні загального IgE, інтерлейкина-4 (ИЛ- 4) і інтерлейкина-10 (ИЛ- 10) визначали за допомогою тест-систем ИФА (ТОВ "Укрмед-Дон", Україна) з використанням імуноферментного аналізатора "Stat-Fax 2100" (США). Групу контролю склали 95 практично здорових осіб з бази генетичних зразків НІІ генетичних і імунологічних основ розвитку патології і фармакогенетики ВДНЗУ "УМСА". Математичну обробку отриманих даних здійснювали з використанням програми "STATISTICA 6.0" (StatSoft Inc). Результати досліджень. При дослідженні поліморфізму гена Asp299Gly TLR4 хворих АР частота "дикого типу" генотипу TLR2 GG склала 93,3 %, частота гетерозиготного генотипу GA - 6,6 %, мутантний генотип АА не був виявлений. В результаті проведеннях досліджень виявлена достовірна різниця між групами хворих АР з наявністю мутантної алелі 2258g/A гена TLR2 і гомозиготними носіями "дикою" алелі за показником CD4+ (U (n=42;n= 3) = 12,00; p = 0,020). Група хворих АР з мутантною алелею 2258g/A гена TLR2 відрізнялася достовірно більш високим значенням лімфоцитів (U (n = 42; n = 3) = 11,50; p = 0,019) від групи хворих АР гомозиготних носіїв "дикої" алелі. Проведене дослідження дозволяє припустити, що поліморфізм 2258g/A гена TLR2 впливає на перебіг захворювання і підтверджує патогенетичний взаємозв'язок між природженим і адаптивним імунітетом при АР; Резюме;Актуальность. Сегодня существует тенденция к росту уровня распространенности аллергических заболеваний в разных странах мира, одним из самых распространенных среди которых является аллергический ринит (АР). По современным представлениям АР – мультифакторная патология, возникающая в результате взаимодействия различных факторов окружающей среды и наследственной предрасположенности. Количество патологий с нарушениями в системе TLR растет. Для лучшего изучения и понимания генетической предрасположенности к возникновению заболевания обоснованным является изучение распространенности функционального полиморфизма гена TLR 2 среди больных АР. Целью исследования стало изучение полиморфизма 2258G/A гена TLR2 (rs5743708) среди больных АР, анализ иммунологических показателей и клинических проявлений у больных с полиморфными вариантами исследуемых генов. В исследовании проанализированы клинические проявления, состояние клеточного и гуморального иммунитета и распространенность полиморфных аллелей 2258 G/A гена TLR2 среди больных АР (n = 45) для изучения механизмов патогенеза и понимания генетической предрасположенности к возникновению этого заболевания. Обследованы 45 больных АР в возрасте от 19 до 65 лет. Диагноз АР устанавливали на основе критериев диагностики ARIA (2008) по алгоритму диагностики, принятым в Украине и утвержденным МЗ Украины. Сенсибилизацию к аллергенам диагностировали на основании комплекса аллергологических методов обследования: сбор аллергологического анамнеза, положительных кожных скарификационных тестов на аллергены с использованием стандартных наборов (ООО «Иммунолог», Винница, Украина). Выделение геномной ДНК осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции. Определение полиморфизма 2258 G/A гена TLR2 проведено методом полимеразной цепной реакции. По стандартной методике проведено определение числа лейкоцитов в крови и подсчет форменных элементов крови в мазках. Фенотип лимфоцитов анализировали в венозной крови, используя моноклональные антитела к CD4, СD25 (производство «Сорбент», Россия) и внутриклеточного белка Foxp3 («Bioscience», США) методом проточной цитофлюориметрии с помощью проточного цитофлюориметра EPIX LX-MCL (Beckman Coulter, США), используя программу System II TM software. Уровни общего IgE, интерлейкина-4 (ИЛ-4) и интерлейкина-10 (ИЛ-10) определяли с помощью тест-систем ИФА (ООО «Укрмед-Дон», Украина) с использованием иммуноферментного анализатора «Stat–Fax 2100» (США). Группу контроля составили 95 практически здоровых лиц из базы генетических образцов НИИ генетических и иммунологических основ развития патологии и фармакогенетики ВДНЗУ «УМСА». Математическую обработку полученных данных осуществляли с использованием программы «STATISTICA 6.0» (StatSoft Inc). Результаты исследований. При исследовании полиморфизма гена Asp299Gly TLR4 больных АР частота «дикого типа» генотипа TLR2 GG составила 93,3 %, частота гетерозиготного генотипа GA – 6,6 %, мутантный генотип АА не был выявлен. В результате проведения исследований выявлена достоверная разница между группами больных АР с наличием мутантной аллели 2258G/A гена TLR2 и гомозиготными носителями «дикой» аллели по показателю CD4+ (U(n=42;n= 3)= 12,00; p = 0,020). Группа больных АР с мутантной аллелью 2258G/A гена TLR2 отличалась достоверно более высоким значением лимфоцитов (U(n = 42; n = 3) = 11,50; p = 0,019) от группы больных АР гомозиготных носителей «дикой» аллели. Проведенное исследование позволяет предположить, что полиморфизм 2258G/A гена TLR2 влияет на течение заболевания и подтверждает патогенетическую взаимосвязь между врожденным и адаптивным иммунитетом при АР; Summary:Urgency: there is a tendency to increase in the prevalence of allergic dis¬eases in different countries, one of the most common of which is allergic rhi¬nitis <AR). According to modem concepts AR multifactorial pathology that occurs in the case of the interaction of various environmental factors and genetic predisposition . Number of pathologies with impaired TLR are already growing. For better learning and understanding of genetic predisposi - lion to the examiner is to examine the prevalence of functional TLR2gene polymorphism among patients with RA. The aim of our study was to study the polymorphism 2258G/A gene TLR2 (rs5743708) among patients with A R, analysis of immunological parameters and clinical manifestations in patients with polymorphic variants studied genes. The study analyzed the clinical manifestations, the state of cellular and humoral immunity and prevalence of polymorphic alleles 2258G/A TLR2 gene among patients with AR (n = 45) to study the mechanisms of pathogenesis and understanding the origin of genetic predisposition to the disease. Examination 45 patients with A R aged 19 to 65 years. The diagnosis of A R establish diagnostic criteria based on ARIA (2008) algorithm for diag¬nosis adopted in Ukraine and approved by the Ministry of Health of Ukraine. Sensitization to allergens diagnosed on the basis of complex allergy survey methods: collection allergic history, positive skin tests to allergens skaryfi- katsiynyh using standard kits (LLC «Immunologist», Vinnitsa, Ukraine). Bold genomic DNA was performed by plienol-chloroform extraction. Identification of polymorphism 2258G/A gene TLR2 conducted by poly¬merase chain reaction. According to the standard procedure was conducted to determine the number of leukocytes in the blood and counting of blood cells in smears. Lymphocyte phenotype was analyzed in venous blood using monoclonal antibodies to CD4, SD25 (production of «sorbent», Russia) and intracellular protein FoxpJ (« Bioscience», USA) by flow tsytoflyuorymetriyi by flow tsyto- flyuorymetra EPIX LX-MCL (Beckman Coulter, USA) using a program called System II TM software. Levels of total IgE, interleukin-4 (IL-4) and interleukin- W(IL-IO) were determined using ELISA kits (LLC «Ukrmed- Don», Ukraine) using ELISA analyzer «Slat-Fax 2100» (U.S). The control group was 95 healthy individuals from a database of genetic samples Institute of Genetic and immunological basis of disease and pharmacogenetics VDNZU *UMSA». Mathematical treatment of the data was performed using the program -STATISTICA 6.0» (StatSoft Inc). Studies. In the studied polymorphisms Asp299Gly TLR4 gene of patients with AR frequency of «wild-type» TLR2 GG genotype was 93,3 %, the frequency of heterozygous genotype GA — 6,6 %, mutant geno¬type AA was not delected. As a result of the studies found significant differences between the groups of patients with A R with the presence of mutant alleles 2258G/ A TLR2gene and homozygous carriers of «wild» alleles in terms of CD4+ (U(n=42;n= 3)= 12,00; p = 0,020). Group of patients with mutant AR alellyu 2258G / A gene for TLR2 differ sig¬nificantly higher value of lymphocytes (U(n = 42; n = 3) = 11,50; p = 0,019) from a group of patients with AR homozygous carriers of «wild» alleles. This study makes it possible to speculate polymorphism 2258G/A gene TLR2 is important in determining the course of the disease, cofirming the pathogenetic link between innate and adaptive immunity in A R.