Висока інформативність молекулярно-біологічних маркерів

Abstract

Насиченість геномів мікросателітними послідовностями є результатом дії факторів, які визначають їх композиційні, структурні та термодинамічні особливості. Мікросателіти можуть знаходитись в геномі скрізь, як в некодуючих, так і в кодуючих послідовностях, впливаючи на транскрипційну активність. Поліморфізм мікросателітів може бути виявлений їх морфологічними характеристиками. Інтенсивне подовжання мікросателітних послідовностей за рахунок реплікаційних помилок має назву мікросателітної експансії. Здатність повторів до експансії залежить від довжини мікросателітної послідовності. Співвідношення між мутаційними подіями, що призводять до збільшення мікросателітних послідовностей за рахунок додавання повтору, співвідносяться з кількістю мутацій, що призводять до зменшення кількості повторів в мікросателітах людини як 10:4. Поліморфізм мікросателітів може визначатись їх локалізацією та орієнтацією в геномі. Вторинна структура ДНК розглядається сьогодні як причина експансії мікросателітних послідовностей. Сама вторинна структура ДНК є похідною термодинамічних характеристик її послідовності. Розрахунки термодинамічних характеристик повторюваних послідовностей дозволили розробити ряд модельних систем, оцінюючих здатність мікросателітних послідовностей впливати на модифікації ДНК, формуючи різні вторинні структури, пов’язані з нестабільністю мікросателітів. Існує дві групи маркерів, що отримують в результаті PCR: перша –відома як STSs (sequence-tagged sites) з праймерами, сконструйованими з відомих послідовностей, і друга – що базується на довільних праймерах. Найінформативніший або поліморфний STS-маркер з’являється тоді, коли ампліфікується дільниця ДНК, що вміщує послідовності мікросателітних повторів. Такий маркер, базується на STS, і позначений як simpl-sequence length polymorphism (SSLP) або sequence-tagged microsatellit site (STMS). Кожний STMS- маркер детектує успадковані по Менделю кодомінантні алелі в одиничному локусі в геномі; Насыщенность геномов микросателлитными последовательностями являются результатом действия факторов, которые определяют их композиционные, структурные и термодинамические осо- бенности. Микросателлиты могут находиться в геноме везде, как в некодирующих, так и в кодирующих последовательностях, влияя на транскрипционную активность. Полиморфизм микросателлитов может выявляться их морфологическими характеристиками. Интенсивное удлиннение микросателлитных по- следовательностей за счёт репликационных ошибок называется микросателлитными экспансиями. Способность повторов к экспансии зависит от длины микросателлитной последовательности. Соотношение между мутационным влиянием, которое ведёт к увеличению микросателлитных последовательностей за счёт прибавления повтора, соотносится с количеством мутаций, которые приводят к уменшению количества повторов в микросателлитах человека как 10:4. Полиморфизм микросателлитов может определяться их локализацией и ориентацией в геноме. Вторичная структура ДНК рассматривается сегодня как причина экспансии микросателлитных последовательностей. Сама вторичная структура ДНК является производной термодинамических характеристик её последовательности. Расчёты термодинамических характеристик повторяющихся последовательностей позволили разработать ряд модельных систем, оценивающих способность микросателлитных последовательностей влиять на модификации ДНК, формируя разные вторичные структуры, связанные с нестабильностью микросателлитов. Существует две группы маркеров, которые получают в результате PCR: первая – известна как STSs (sequence-tagged sites) с праймерами, сконструированными из известных последовательностей, и другая – которая базируется на свободных праймерах. Наиболее информативный или полиморфный STS- маркер появляется тогда, когда амплифицируется участок ДНК, который содержит последовательности микросателлитных повторов. Такой маркер, базируется на STS, и отмечен как simpl-sequence length polymorphism (SSLP) или sequence-tagged microsatellit site (STMS). Каждый STMS-маркер детектирует унаследованные по Менделю кодоминантные алели в единичном локусе в геноме; Relative saturation of genomes with any mictosatellite sequences is the result of influence of many factors, which all in all determine composite, structural and thermodynamic features of genomic mictosatellite sequences. Mictosatellites may be formed in two ways. One of the resources of evolution of simple repeats in eukaryotes is poly (A)-tracks. The latter are located at the 3’ends of such mobile elements. The second potential possibility of formation of mictosatellite sequences consists in replicative extension or shortening of protomicrosatellites, which can be formed in the genome due to mutative events. Such mictosatellites must have minimal number of repeats (3-5) to change its length due to formation of bulges during the transcription. Generally, the number of long mictosatellite repeats is not big. Only 12 % of all mictosatellites in human genome, for example, have more than 40 nucleotides. But there is a possibility of transformation of single mictosatellite repeat into composite one, consisting of two sequences with different replicable motives. This may occur due to mutations in one of the repeats and its duplication due to replication errors. Mictosatellites can be presented in the genome everywhere, both in noncoding and coding sequences, affecting transcriptional activity. Polymorphism of mictosatellites can be identified by their morphological characteristics. The difference in the degree of polymorphism between various mictosatellites may depend first on the length of mictosatellite sequence itself. The majority of mictosatellite mutations are associated with insertions or deletions of specific repeats, emerging during replication. Such disorder of stability of mictosatellites more often occurs due to formation of bulges on DNA during replication (“slippage”). Intensive extension of mictosatellite sequences due to replication errors is called mictosatellite expansion. The ability of repeats to expansion depends on the length of mictosatellite sequence. The relations between mutative events, leading to expansion of mictosatellite sequences due to addition of a repeat, correlates with number of mutations, which lead to reduction of repeats in human mictosatellites as 10:4. In some of mictosatellite repeats the replication errors are mostly associated with 3’-end: (GA)n and (CA)n, and in another ones with 5’-end – (CG)n and (CT)n. In trinucleotide GC-multiple repeats the proximal 3’-end, relative to the direction of replication, has positive impact on the frequency of replicative error. Despite the fact that a bulge at the 3’-end originates during each replicative tour, this error 99 % is corrected by the system of reparation. Change in length of mictosatellite sequence is occurred once per 100 replications.Among trinucleotide repeats these properties are ultimately presented by GC-multiple repeats, too, such as (CAG)n, (CTG)n, (GGC)n and (GCC)n. The pattern and regularities of distribution of these trinucleotide microsatellites in the genome is of special interest due to the role they play in the development of oncologic diseases. Currently, they are the most examined mictosatellite sequences. They are assigned to the number of most expressed in the coding regions of human genome. Likewise, instability of dinucleotide mictosatellites is connected with development of certain oncologic disease. Replicative errors in dinucleotide repeats are more often related to deletions, which lead to reading frame shifting. Study of the mechanisms, which lead to mutative events in mictosatellite sequences, showed that these events, both in normal and malignant cells, are based on the same mechanisms. Number of point mutations is confirmed in the mictosatellite DNA at one level, regardless of its characteristics. But in mictosatellites themselves, there are zones where such mutations emerge more often. There are three mechanisms, producing mutations in these sequences: insertion, deletion, replacement and disorder of replicable motive. Polymorphism of mictosatellites can be identified by their localization and orientation in genome. The secondary structure of DNA is currently viewed as the cause of expansion of mictosatellite sequences. The secondary structure of DNA itself is the derivative of thermodynamic characteristics of its sequence. The secondary bulge-type structures in mictosatellite sequences, identified by their thermodynamic characteristics, can initiate the phenomenon of expansion of mictosatellite repeats. The more stable these bulges, the lower is the risk of formation of new mictosatellite repeats. CAG/CTG and GAC/GTC- triduplex sequences have equal number of hydrogen couplings, but are distinguished by the strength of dense relationships. This is enough to make the first of them more vulnerable for expansion of mictosatellite repeats. Stability of bulge increases in the following direction: GTC < CAG < GAC < CTG, on the contrary, the frequency of formation of new repeats decreases in the similar direction: GTC > CAG > GAC > CTG. Calculations of thermodynamic characteristics of replicable sequences allow developing number of model systems, evaluating the ability of mictosatellite sequences to influence the DNA modifications, forming various secondary structures, related to phenomenon of expansion of mictosatellite repeats. Types of markers, obtained as a result of PCR, are divided into two groups on the basis of primers’ design: the first group is known as STSs (sequence-tagged sites) with primers, constructed from known sequences, and the second one is based on the random primers. The most informative or polymorphic STS-marker emerges during amplification of DNA-area, containing sequences of mictosatellite repeats. This marker is based on STS, and is marked as simple-sequence length polymorphism (SSLP) or sequence-tagged microsatellite site (STMS). Each STMS-marker detects inherited Mendelian codominant alleles in single locus in genome.