Peculiarities of metabolism (by level of nitrates, nitrites, malondialdehyde and sialic acids) in 6-9 months old infants born from mothers with metabolic syndrome, who had hypoxic-ischemic encephalopathy in the early neonatal period

Abstract

За даними Всесвітньої організації охорони здоров’я основними неврологічними причинами інвалідності та смертності новонароджених дітей залишаються асфіксія та гіпоксично-ішемічна енцефалопатія. Ступінь ушкодження головного мозку та подальші неврологічні ускладнення визначаються низкою факторів, зокрема тривалістю гіпоксії/ішемії, мозковим кровообігом, незрілістю центральної нервової системи новонароджених, соматичним статусом матерів. Метою дослідження було встановити особливості метаболізму (за рівнем нітратів, нітритів, малонового діальдегіду та сіалових кислот) у немовлят 6-9 місячного віку, які народилися від матерів з метаболічним синдромом, і які мали гіпоксично-ішемічну енцефалопатію в ранньому неонатальному періоді, а також вплив варіантів генів eNOS (G894T), IL-1b (C3953T) на обмін даних метаболітів. Матеріали та методи. Для досягнення мети проведено проспективне дослідження «випадок-контроль», в яке включено 30 дітей віком 6-9 місяців. Основну групу дослідження склали 16 дітей, які народилися від матерів з метаболічним синдромом і які мали оцінку за шкалою Апгар менше за 7 балів на 5 хвилині, а також мали діагностичні клінічні та нейросонографічні ознаки гіпоксично-ішемічної енцефалопатії, що були виявлені при консультуванні дитячим неврологом у віці 6-9 місяців життя. Групу порівняння складали 14 рандомно відібраних відносно здорових дітей віком 6-9 місяців, які народилися від матерів без метаболічного синдрому і які не мали проявів гіпоксично-ішемічної енцефалопатії в ранньому неонатальному періоді. Концентрацію нітритів визначали шляхом визначення діазосполук, що утворилися у реакції з сульфаніловою кислотою, а потім проводили реакцію з α-нафтиламіном (Реактив Грісса-Ілосвая). Концентрацію вільного малонового діальдегіду визначали методом спектрофотометричного визначення. Концентрацію сіалових кислот в сечі визначали за реакцією з оцтво-сірчанокислим реактивом (реакція Гесса). Молекулярно-генетичний аналіз було проведено з використанням букального епітелію в якості біологічного матеріалу. Визначення поліморфних варіантів IL-1β 3953C>T (rs1143634) та eNOS G894Т (rs1799983) проводилось методом полімеразної ланцюгової реакції за допомогою комерційного набору «DreamTaq Green PCR Master Mix» (Thermo Scientific, США) та специфічних олігонуклеотидних послідовностей (Metabion, Німеччина). Статистичний аналіз. Для обробки кількісних величин використовували традиційні методи параметричної та непараметричної статистики: для аналізу якісних ознак, що виражалися в основному у відсотках, було застосовано непараметричні методи. За нормального розподілу даних використовували основні статистичні характеристики, а саме: середнє значення (М) для визначення центральної тенденції; стандартну похибку середнього значення (m) для точності оцінки середньої, довірчий інтервал (ДІ) для визначення 95% інтервалу середньої. Гіпотези щодо рівності генеральних середніх перевіряли з використанням двостороннього t-критерію Стьюдента. Порівняння відносних, або виражених у відсотках, величин виконували за допомогою критерію точного двостороннього критерію Фішера. Зв’язки між лічильними перемінними визначали за допомогою множинного регресійного аналізу за Пуассоном. Статистичний аналіз проводили за допомогою пакету прикладних програм STATA 14.0. Дослідження виконане із дотриманням «Правил етичних принципів проведення наукових медичних досліджень за участю людини», затверджених Гельсінською декларацією (1964-2013 рр.), ICH GCP (1996 р.), Директиви ЄЕС № 609 (від 24.11.1986 р.), наказу МОЗ України № 690 від 23.09.2009 р. та підтверджено висновком Комісії з питань біомедичної етики Полтавського державного медичного університету (Протокол № 233 від 21.11.2024 року) схвалила дослідження. На проведення досліджень було отримано письмову згоду батьків новонароджених дітей. Дослідження виконано в рамках НДР кафедри педіатрії №1 із неонатологією Полтавського державного медичного університету «Розробити клініко-лабораторні критерії, методи прогнозування та запобігання метаболічних порушень у дітей раннього віку», реєстраційний номер 0120U102856, термін виконання 2020-2024 рр. Результати дослідження. Дослідження показників обміну оксиду азоту у групі обстежуваних дітей показало, що у малюків з гіпоксично-ішемічною енцефалопатією в період 6-9 місяців життя концентрація нітритів була значно вищою 2,69 нмоль/л порівняно зі здоровими дітьми 1,39 нмоль/л (p<0,001). Аналогічні відмінності отримані і в концентрації нітратів (5,41 vs 2,62; р<0,001). Нами не було отримано достовірних відмінностей у рівнях нітратів, нітритів та малонового діальдегіду залежно від генотипів гену IL1B (C3953T, rs1143634), проте ми виявили вищу (на рівні р<0,1) концентрацію сіалових кислот у дітей з генотипом СС, ніж у дітей з генотипом СТ або ТТ. При дослідженні гену eNOS (G894T, rs1799983) ми не отримали достовірних відмінностей у рівнях нітратів, нітритів, сіалових кислот та малонового діальдегіду у дітей з різними генотипами. Дослідження виявило достовірний прямий зв’язок (на рівні р<0,1) між рівнем нітратів в сечі у дітей обстежених груп та концентрацією сіалових кислот (Coef. 0,753, р=0,062). Висновок. Результати дослідження свідчать про підвищення рівнів нітратів (5,41 vs 2,62; р<0,001) та нітритів (2,69 vs. 1,39; р<0,001) у дітей від матерів з метаболічним синдромом у відновному періоді гіпоксично-ішемічної енцефалопатії, що може вказувати на прогресування патологічних процесів, викликаних гіпоксичним ураженням або ж свідчити про адаптивні механізми відновлення після ушкодження тканин головного мозку. Також було виявлено достовірний прямий зв'язок між рівнем нітратів в сечі у дітей обстежуваних груп та концентрацією сіалових кислот (Coef. 0,753, р=0,062). При цьому ці зміни не асоціювалися з оліморфними варіантами генів eNOS (G894Т, rs1799983) та IL1B (C3953T, rs1143634). Таким чином, визначення концентрації рівня нітратів та нітритів можуть бути впроваджені в клінічну практику для ранньої діагностики та прогнозування можливих ускладнень у дітей з гіпоксично-ішемічною енцефалопатією, оскільки підвищений рівень нітритів, нітратів та сіалових кислот може слугувати маркером віддалених наслідків гіпоксичного ураження. Це дозволяє розглядати їх як перспективні предиктори неоптимального нервово-психічного розвитку дитини.

According to the World Health Organization, asphyxia and hypoxic- ischemic encephalopathy remain the leading neurological causes of disability and mortality in newborns. The degree of brain damage and subsequent neurological complications is determined by a number of factors, including duration of hypoxia/ischemia, cerebral circulation, neonatal central nervous system immaturity, and maternal somatic status. The aim of the study was to determine the metabolic characteristics (by nitrate, nitrite, malondialdehyde and sialic acid levels) of infants aged 6-9 months born to mothers with metabolic syndrome who had hypoxic- ischemic encephalopathy in the early neonatal period, and the eff ect of eNOS (G894T) and IL-1b (C3953T) gene variants on the metabolism of these metabolites. Materials and methods. To this end, a prospective case-control study was conducted in 30 children aged 6-9 months. The main study group consisted of 16 children born to mothers with metabolic syndrome who had an Apgar score of less than 7 points at 5 minutes and diagnostic clinical and neurosonographic signs of hypoxic- ischemic encephalopathy, as determined during a consultation with a pediatric neurologist at 6-9 months of age. The comparison group consisted of 14 randomly selected relatively healthy children aged 6-9 months, born to mothers without metabolic syndrome and without manifestations of hypoxicischemic encephalopathy in the early neonatal period. The concentration of nitrites was determined by determining the diazo compounds formed in the reaction with sulfanilic acid, and then the reaction was carried out with α-naphthylamine (Grisse- Ilosway reagent). The concentration of free malondialdehyde was determined by the spectrophotometric method. The concentration of sialic acids in urine was determined by the reaction with acetic- sulfuric acid reagent (Hess reaction). Molecular genetic analysis was carried out using buccal epithelium as biological material. Determination of IL1B 3953C>T (rs1143634) and eNOS G894T (rs1799983) polymorphic variants was carried out by polymerase chain reaction using the commercial kit «DreamTaq Green PCR Master Mix» (Thermo Scientifi c, USA) and specifi c oligonucleotide sequences (Metabion, Germany). Statistical analysis. Traditional methods of parametric and non-parametric statistics were used to process quantitative values; non-parametric methods were used for the analysis of qualitative characteristics expressed mainly in percentages. Under the normal distribution of data, the main statistical characteristics were used, namely: the average value (М) to determine the central tendency; the standard error of the mean (m) for the precision of the estimate of the mean, the confi dence interval (CI) for determining the 95 % interval of the mean. Hypotheses regarding the equality of general means were tested using a two-tailed Student’s t-test. Comparison of relative or percentage values was performed using Fisher’s exact two-sided test. Relationships between count variables were determined using Poisson multiple regression analysis. Statistical analysis was performed using the STATA 14.0 software package. The study was conducted in compliance with the ‘Rules for Ethical Principles for Scientifi c Medical Research Involving Human Subjects’ approved by the Declaration of Helsinki (1964-2013), ICH GCP (1996), EEC Directive 609 (24.11.1986), Order of the Ministry of Health of Ukraine No. 690 of 23.09.2009 and confi rmed by the conclusion of the Biomedical Ethics Commission of Poltava State Medical University (Protocol No. 233 of 21.11.2024), which approved the study. Written consent was obtained from the parents of the newborns. The study was conducted within the framework of the joint budget research work of the Department of Pediatrics № 1 with Neonatology of the Poltava State Medical University on the topic «Development of clinical and laboratory criteria, methods for predicting and preventing metabolic disorders in children of early age», state registration number 0120U102856, term of execution 2020-2024. Research results. A study of the indicators of nitric oxide exchange in the group of examined children showed that the concentration of nitrites was signifi cantly higher in children with hypoxic ischemic encephalopathy in the period of 6-9 months of life, 2.69 nmol/l compared to healthy children, 1.39 nmol/l (p<0.001). Similar diff erences were obtained in the concentration of nitrates (5.41 vs 2.62; p<0.001). We did not obtain signifi cant diff erences in the levels of nitrates, nitrites and malondialdehyde depending on the genotypes of the IL1B gene (C3953T, rs1143634), but we found a higher (at the level of p <0.1) concentration of sialic acids in children with the СС genotype than in children with СT or TT genotype. When studying the eNOS gene (G894T, rs1799983), we did not fi nd signifi cant diff erences in the levels of nitrates, nitrites, sialic acids and malondialdehyde in children with diff erent genotypes. The study revealed a reliable direct relationship (at the level of p<0.1) between the level of nitrates in the urine of children of the examined groups and the concentration of sialic acids (Coef. 0.753, p=0.062). Conclusion. The results of the study indicate an increase in the levels of nitrates (5.41 vs. 2.62; p<0.001) and nitrites (2.69 vs. 1.39; p<0.001) in children of mothers with metabolic syndrome in the recovery period of hypoxic ischemic encephalopathy, which can indicate the progression of pathological processes caused by hypoxic damage or testify to the adaptive mechanisms of recovery after brain tissue damage. A reliable direct relationship was also found between the level of nitrates in urine in children of the examined groups and the concentration of sialic acids (Coef. 0.753, p=0.062). At the same time, these changes were not associated with polymorphic variants of the eNOS (G894T, rs1799983) and IL1B (C3953T, rs1143634) genes. Thus, determining the concentration of nitrates and nitrites can be implemented in clinical practice for early diagnosis and prediction of possible complications in children with hypoxic ischemic encephalopathy, because the increased level of nitrites, nitrates and sialic acids can serve as a marker of distant consequences of hypoxic damage. This allows us to consider them as promising predictors of a child’s suboptimal neuropsychological development.